Imunosupresivi

Balansiranje toksičnosti i imunosupresije

Danas, liječnici primjenjuju kombinirane terapije calcineurin inhibitora i mTOR inhibitora kako bi se smajile doze pojedinačnog imunosupresora, čime se smanjuje toksičnost obje skupine lijekova. Ponekad, mycofenolate mofetil, antiproliferativni lijek, može biti dodan u kombinaciju kako bi se još više smanjile doze drugih imunosupresivima.

Terapijsko praćenje (TDM) imunosupresivnih lijekova nastoji uravnotežiti toksičnost i imunosupresiju odgovarajuće terapije kako bi se spriječilo odbacivanje. Toksičnoj strani ravoteže pridodaju se: kardiovaskularne bolesti, dijabetes, hipertenzija, hiperlipidemija, infekcije, nefrotoksičnost, neurotoksičnost, malignost, i metaboličke bolesti kostiju. Ove nuspojave često doprinose kardiovaskularnim bolestima i često se pojavljuju. Na primjer, nefrotoksičnost calcineurin inhibitora je gotovo ista i 10 godina nakon transplantacije (3).

Farmakokinetika i farmakogenetika

Apsorpcija i metabolizam imunosupresiva varira i unutar i između pojedinaca. Calcineurin inhibitori i mTOR inhibitori se oksidiraju u citohromu CYP3A u jetri i crijevima. Ekspresija CYP3A aktivnosti i naknadni transport P glikoproteina iz zidova debelog crijeva u jetru genetski je određena. Istraživači su također povezli ekspresiju CYP3A aktivnosti na etničkim skupinama. Otprilike 15-25% bijelaca i 70% afroamerikanaca posjeduju ekspresiju CYP3A5 aktivnosti. Ove varijacije u aktivnosti CYP3A5 može dovesti do dvostrukog povećanja tacrolimusa uzrokujući da ekspresor enzima zahtijeva dozu tacrolimus-a 2-3 puta veću nego ne-ekspresor (1).

Ostali faktori također doprinose intra- i inter-individualnoj varijabilnosti bioraspoloživosti lijeka. Ti faktori uključuju: promjene u funkciji jetre, toka žuči , proljevi ili gastrointestinalna hirurgija; istovremeno liječenja s drugim lijekovima metaboliziranim od strane P450 sistema; vremena nakon transplantacije, te dobi – pedijatrijski bolesnici metaboliziraju imunosupsresive brže od odraslih. Dijeta također utječe na apsorpciju imunosupresora; viši unos masnoća dovodi do manje apsorpcije, te namirnice poput grejpa koji utječu na P450 sistem rezultirajući promjenama metabolizama. Tajmiranje unosa hrane u odnosu na unos lijekova također moge uticati na koncentraciju imunosupresiva . Zbog svih tih razloga, bioraspoloživost lijeka može varirati od 5 do 40%.

S obzirom na uski prozor koji razdvaja adekvatnu imunosupresiju od toksičnosti, imperativ je da pacijenti prate i prilagođavaju nivoe lijekova.

Analiza imunosupresora

Naravno, analitički problemi za kontrolu terapije imunosupresanta ostaju ključni problem za laboratoriju. Sirolimus-u pohranjen na >30 °C nema stabilnosti, čineći prevoz uzoraka komplikovanim. Rano u razvoju analitičkih metoda, veliki problem s ciklosporinom, a kasnije sa analizom takrolimus-a i sirolimus-a, bila je analiza matrica: serum ili plazma u odnosu na punu krv. Matrica je problem kod tih lijekova, jer promjene temperature mogu izazvati da se vežu na crvene krvne stanice drugačije. 1990. usaglašeno je da je puna krv uzorak izbora.

Druga prepreka kod analize imunosupresora je da li primjeniti osnovni lijek ili osnovni lijek plus metabolite. U krvotoku , svaki od imunosupresivnih lijekova se pretvara u više metabolita. Neki od metabolita posjeduju imunosupresivna svojstva, dok su drugi nefrotoksični. Nadalje, odnos metabolita i osnovnog lijeka se može promijeniti, pogotovo s promjenom funkcije jetre. Na temelju preporuka konsenzus foruma, laboratoriji su ustanovili monoklonski osnovni spoj kao odgovarajuću metu za analizu. Preporuka je takođe da su ciljne razine više organ-specifične i slične od institucije do institucije, iako neke međuinstitucionalne varijacije na temelju metodoloških razlika još uvijek ostaju i danas.

Metode imunoanalize

Za razliku od starijih heterogenih kompetitivno vezujućih metoda, novije antitijelo-bazirane metode mjerenja imunosupresora ne zahtijevaju razdvajanje vezanog od slobodnog lijeka. Mnogi testovi također su sada dostupni na kliničko-hemijskim analizatorima koji su rutinski dio temeljne laboratorijske instrumentacije. Ove homogene metode uključuju: affinity column-mediated imunoanaliza (ACMIA); hemilumniscentna mikročestična imunoanaliza; direktna hemiluminescentna imunoanaliza; enzim-multiplicirana imunoanaliza; polarizacija floroscencije, i mikročestična enzimska imunoanaliza (MEIA).

Jedan je problem zajednički za sve konkurentne vezujuće metode: uzajamna reaktivnost s metabolitom ili heterofilnim antitijelom. U principu, unakrsna reaktivnost uzrokuje da imunoanalize imaju pozitivnu pristrasnost u odnosu na hromatografske metode. Kada se koriste antitijela-bazirane metode, važno je biti upoznat sa uzajamnom reaktivnosti, koja se može naći na ambalaži proizvođaća. Tabele 1-3 prezentiraju uzajamne reaktivnosti različitih imunometoda za ciklosporin, takrolimus i sirolimus, zajedno sa njihovim bioaktivnostima i koncentracijama u odnosu na osnovni spoj. Laboratorije moraju biti svjesne da nisu sve uzajamne reaktivnosti identificirane i da koncentracije u odnosu na osnovni spoj mogu varirati, posebno s oštećenjem jetre.

{modal url=http://www.laboratorij.ba/index.php?option=com_content&view=article&id=571}Tabela 1. Unakrsna reaktivnost glavnih metabolita Cyclosporina{/modal}

{modal url=http://www.laboratorij.ba/index.php?option=com_content&view=article&id=572}Tabela 2. Unakrsna reaktivnost glavnih metabolita Sirolimusa{/modal}

{modal url=http://www.laboratorij.ba/index.php?option=com_content&view=article&id=573}Tabela 3. Unakrsna reaktivnost glavnih metabolita Tacrolimusa{/modal} 

Još jedan koristan alat za ispitivanje unakrsne reaktivnost je komparativno testiranje rezultata sakupljenih uzoraka. Slika 1 prikazuje testove za ciklosporin, sirolimus i takrolimus na sakupljenim transpantiranim uzorcima koštane srži ili jetre.

Cyclosporine, Koštana srž

Sirolimus, Jetra

Tacrolimus, Jetra

Slika 1. Ova slika pokazuje inter-institucionalnu preciznost svake metode i broj sudionika po metodi.

Skraćenice : ADVIA, ADVIA kentaur; CMIA, hemiluminescentna mikročestična imunoanaliza; HPLC / MS, likvidna hromatografija visokih performansi / masena spektrometrija ; ACMIA; CEDIA, klonirani enzim-donor imunoanaliza; EMIT, enzim-multiplicirana imunoanaliza; FPIA, imunoanaliza polarizovane floroscencije ; RIA radioimunoanaliza, i HPLC / UV, likvidna hromatografija visokih performansi / UV detekcija. Izvor: Analytical Services International, Ltd.

 

Postoje druga dva problema imunoanalize , oba se odnose na ekstrakciju, koja je specifična za svaku metodologiju antitijela. Na primjer, poznato je da na MEIA metode utiče hematokrit. Laboratoriji su primijetili nešto oko 20% lažnog povećanja nivoa sirolimus-a kada je hematokrit smanjen za 20%. Nadalje, procentualna razlika uzrokovana smanjenim hematokritom je veća kod nižeg terapijskog raspona. Smetnje uzrokovane hematokritom su vjerojatno zbog inverznog odnosa između učinkovitosti ekstrakcije i hematokrita (4). Kao što se očekivalo, primjetan je problem i kod imunoanalize takrolimus-a. U jednoj studiji, istraživači su otkrili niske pozitivne rezultate takrolimus-a koristeći se MEIA metodom u anemičnih bolesnika koji nisu primali imunosupresive (5). U bolesnika kod kojih vrijednosti hematokrita variraju iz dana u dan, ovo pitanje svakako treba uzeti u obzir. Kliničari bi trebali biti svjesni da MEIA razine mogu biti korisne za otkrivanje promjena u razinama imunosupresora kod anemičnih bolesnika gdje je nizak hematokrit konstantan, ali oni bi također trebali ostati svjesni da postoji pozitivan odnos MEIA metoda i uzoraka s niskim hematokritom.

Istraživači su također uočili lažna povećanja nivoa takrolimus-a u 1% analiziranih uzoraka sa ACMIA, u nekim slučajevima čak 20 puta iznad referentnih raspona (6). Oni su pretpostavili da su takva lažna povišenja zbog prisutnosti uticaja endogenih antitijela koji se ne uklanjaju prethodnom obradom. Povišene razine se najvjerovatnije mijenjaju s vremenom, od pojedinca do pojedinca.

Automatizirani imonotestovi imunosupresora osigurava veću jednostavnost korištenja i fleksibilnosti. “Siemens Healthcare Diagnostics Dimension” i “Abbott Architect” automatski analizatori imaju relativno nove analize imunosupresora za sve tri glavne grupe. Siemens koristi ACMIA metodu bez predtretmana i nudi pozitivanu identifikaciju uzoraka tokom cijelog procesa. Proizvođač ja naglasio funkcionalnu osjetljivost za takrolimus koja je 2,4 ng / ml. Abbott takođe posjeduje MEIA metodu. Test zahtijeva nešto drugačiju pre-analitičku obradu za svaki od imunosupresiva i ne daju pozitivnu identifikaciju pacijenta. Navedena funkcionalna osjetljivost takrolimus-a kod Abbott-a je <2 ng/ml. 2009. European Consensus Conference by the Committee on Tacrolimus Optimization preporučuje ciljne razine takrolimus-a od 2-4 ng / ml, što bi zahtijevalo ograničenje kvantificiranja ispod terapijskog raspona, idealno oko 1 ng / ml (7).

Prilikom odabira automatizirane imunometode, osjetljivost je očito važna, ali osjetljivost zajedno s preciznošću određuje razinu pouzdanosti. Postoje izvještaji o adekvatnosti preciznosti na niskim razinama i osjetljivosti za obje ACMIA i MEIA metode. Na temelju tih nalaza, bilo bi pametno samostalno ocijeniti prihvatljivu osjetljivosti i preciznosti bilo koje analize za svaku laboratoriju prije nego ih pođu primjenjivati.

Hromatografske metode

Rane hromatografske metode za imunosupresivne lijekove rutinski su koristile HPLC uređaje (HPLC) s UV detektorom, ali uvođenjem elektroraspršenja i trostrukog quadropole masenog spektrometra (MS / MS) počeo je novi val analitičkih inovacija. Kako su laboratorije usvojile ovu tehnologiju, nedostatak standardiziranih, komercijalno dostupnih kalibratora pojavio se kao problem. Instucionalno kalibriranje HPLC MS / MS metode predstavljalo je poteškoće zbog varijabilnosti vezivanja imunosupresiva sa crvenim krvnim stanicama.

Odabir internih standarda bio drugi analitički problem u razvoju HPLC MS / MS metode. Komercijalno pripremljeni deuterij interni standardi su sada dostupni. Dodavanje individualiziranog internog standarda za svaku analizu imunosupresora, smanjuje broj ponavljanja tačaka koje se izvode na svakom piku mase/naboja , jer se više različitih m/n vrhova skenira u isto vrijeme . Laboratoriji koji odluče koristiti individualizirane interne standarde za svaki imunosupresiv trebaće ubrizgati svaki analit odvojeno.

Tu su i druga analitička razmatranja za hromatografske metode, od kojih su neki specifični za HPLC MS / MS, i drugi, koji nisu. Mogućnost jonske supresije uvijek treba evaulirati u bilo kojoj HPLC MS / MS proceduri. Laboratoriji također trebaju ponovno procijeniti cijelu metodu kada se bilo koji korak u postupku izmjeni. Naizgled beznačajana promjena u postupku ponekad proizvede neočekivane rezultate, i potrebno je uspostaviti procedure za rutinski pregled rezultata unutar testa i između testova, obnovljivost, adekvatnost i dosljednosti internih standardiziranih pikova, i osjetljivost testa. Laboratoriji trebaju pažljivo razviti postupke kako bi osigurao identitet pacijenta tokom procesa ekstrakcije uzorka, posebno kako se broj uzoraka povećava. Ovisno od korištenog predtretmana ekstrakcije, moguće je da isti odnos između učinkovitosti ekstrakcije i hematokrita kod MEIA metode može postojati s HPLC MS / MS. Laboratoriji bi također trebali provjeriti odvajanje metabolita iz osnovnih spojeva za sve hromatografske metode jer neki metaboliti imaju tendenciju da komigriraju s osnovnim spojem.

Neanalitička razmatranja u vezi s hromatografskom analizom imunosupresiva su cijene, propusnost i vrijeme obrta, obuku i zalihe za vrijeme zastoja. Početni instrumentalni trošak za HPLC MS / MS je prilično visok, ali svakodnevni troškovi korištenja su niski, čineći ukupne troškove HPLC MS / MS usporedivim sa imunoanalizom, posebno u situacijama sa velikim obimom posla gdje trošak instrumenta može se raspodjeliti na veći broj testova. U nekim laboratorijima, vrijeme analize može postati ograničavajući faktor. Općenito, propusnost za imunosupresive na HPLC MS / MS je 2-3 minute / ubrizgavnju uzorka, vrijeme koje je usporedivo s imunoanalizom.

Danas, upravljanje sa HPLC MS / MS mnogo više pristupačnije, iako laboratoriji još uvijek trebaju imati namjenskog primarnog operatera za pokretanje instrumenta. Prodavači često nude programe obuke, koji se često prilagođeni laboratorijskim potrebama. Proizvođači su također postali odgovorni na potrebe laboratorija za izvršavanje usluga u klinički relevantnim roku. Kritična priroda tih testova, međutim, zahtijeva rezervni plan u slučaju planiranih i neplaniranih zastoja. Ponekad institucije koje su geografski blizu, koristeći isti instrumentarij i metodologiju, povezati će se i služe kao rezerva jedne drugima, eliminirajući dodatnu cijenu instrumenta.

U principu, HPLC MS / MS metode imaju nižu osjetljivost na imunosupresive nego metode antitijela, međutim, najnižu preciznost HPLC MS / MS je teže procijeniti. Nedavno, komparativno ispitivanje College of American Pathologists i dalje pokazuju prilično visoku standardnu devijaciju za HPLC MS / MS analize imunosupresivima iako su razlike u standardizaciji od institucije do institucije u suštini bile eliminirane. Na kraju, iako se mnogo zna o analitičkim parametarima osjetljivosti, specifičnosti, i preciznosti obje kompetitvno vezujuće i kromatografske analize imunosupresiva, ti podaci nisu povezani s ishodima liječenja pacijenata.

Budućnost praćenja imunosupresora

U budućnosti, s napretkom testiranja osušenih krvnih mrlja poslanih direktno od pacijenta u laboratoriju, poboljšana integracija TDM u životni stil transplantiranih bolesnika može biti moguća. Suhe mrlje krvi će omogućiti pacijentu ne samo prikupljanje uzoraka kod kuće, bez odlaska svojim liječnicima, to bi također značilo da više uzoraka lijeka uzetih odmah nakon administracije može biti prikupljeno. Analiza osušenih mrlja krvi bi omogućila laboratorijama da izračunaju dozu lijeka na osnovu površine ispod krivulje ili tempiranog pika umjesto sadašnje prakse određivanja nivoa.

Trenutno niti jedan ovaj protokol nije moguć jer uzimanje krvi zahtjeva obučenog flobotomista. Zbog dužeg ciklusa, ovaj scenarij bi, međutim, eliminirao prilagodbe doze tokom istog dana trenutno prakticirane kod mnogih liječnika. Genetičko testiranje za usavršavanje imunosupresivne terapije je još uvijek u nedostatku, ali ima potencijal da poboljša odabir lijeka i doziranje. Kao što je spomenuto ranije, pacijenti koji imaju ekspresiju CYP3A mogu zahtijevati 2-3 puta veće doze određenih imunosupresivnih lijekova od pacijenata koji to nemaju.

Gdje nas vodi TDM?

2011, idealna TDM metoda za imunosupresive još nije osmišljena. Idealna metoda bi trebala sadržavati: nisku osjetljivost s dobrom preciznošću; bez unakrsne reaktivnosti ili dobro dokumentiranu unakrsnu reaktivnost s ograničenim kliničkim značajem; nisku cijenu; vremenski ciklus u skladu s pacijentovim potrebama; STAT testiranje dostupnosti; jednostavnost rada i integraciju u laboratoriju; usklađivanje između institucija kako bi se omogućila mobilnost pacijenta i dosljednost u istraživačkim protokolima; adekvatan back-up. Niti jedna metoda nije pokazala superiornost u svim tim aspektima, dakle, laboratoriji trebaju pažljivo odabrati način kako bi se zadovoljile potrebe pacijenata i kliničara.

Dok bolje TDM metode za imunosupresive ne budu dostupne, laboranti trebju biti oprezani u edukaciji korisnika određene metode o njihovim ograničenjima te trebaju upozoriti korisnike da ne koriste različite metode naizmjenično ili da određuju razine ciljnih lijekova na osnovu literature bez razmatranja razlike u metodologiji.

REFERENCE

1. Levy G, Lake JR, Holt DW, Wallemacq P. Current Trends in Transplantation: Drug Therapy and Monitoring. Abbott Park: Abbott Laboratories 2009:6–23 and 61–107.

2. Sayegh MH, Carpenter CB. Transplantation 50 years later-progress, challenges and promises. N Engl J Med 2004; 351:2761–6.

3. Naesens M, Kuypers DR, Sarwal, M. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity. Clin J Am Soc Nephrol 2009;4:481–508.

4. Wilson D, Johnston F, Holt D, Moreton M, et al. Multi-center evaluation of analytical performance of microparticle enzyme immunoassay of sirolimus. Clin Biochem 2006;39:378–386.

5. Taylor PJ, Morris RG. Tacrolimus measurement by microparticle enzyme immunoassay II. Ther Drug Monit 2003;25:259–260.

6. Moscato D, Nonnato A, Adamo R, Vancheri M, et al. Therapeutic monitoring of tacrolimus: aberrant results by an immunoassay with automated pre treatment. Clin Chim Acta 2010;411:77–80.

7. Wallemacq P, Armstrong VW, Brunet M, Haufroid V, et al. Opportunities to optimize tacrolimus therapy in solid organ transplant: report of the European consensus conference. Ther Drug Monit 2009; 31:139–152.